Фотометрические измерения в микропланшетном формате

Фотометрические измерения в микропланшетном формате. Существует широкая сфера приложений фотометрического измерения в микропланшетном формате. Такие сферы исследований включают в себя иммуноферментный анализ (EIA, ELISA), анализ белков, исследование процессов гибридизации, исследования цитотоксинов и изучение процессов размножения клеток новообразований, наблюдение роста бактерий, измерения активности ферментов, и т.д.

Фотометрические измерения

Фотометрические измерения базируются на применении методики измерений по конечной точке, измерений по двум точкам или выполнении кинетических измерений. Процесс обработки измеренных данных зависит от типа анализа. При выполнении количественного анализа, используются стандарты, по которым строится калибровочная кривая. В то же время, при выполнении качественного анализа, применяются расчетные ограничительные уровни.

Количественный анализ — фотометрические измерения

При выполнении количественного анализа, определяется абсолютное значение концентрации измеряемого соединения в пробах. В процессе проведения анализа, используется ряд стандартов с известной концентрацией измеряемого соединения. С помощью известных значений концентрации и измеренных значений оптической плотности стандартов строится калибровочная кривая.

С помощью этой калибровочной кривой выполняется интерполяция значений концентрации искомого соединения в исследуемых пробах. Для построения калибровочной кривой выбирается математическая модель, обеспечивающая наилучшую аппроксимацию кривой. Среди имеющихся различных способов построения кривой, наиболее часто используются: линейная регрессия, кубический сплайн и логистические модели.

Широкий ряд аналитических приложений, например, различные виды иммунологического анализа, исследование гормонов и анализ белков, основаны на использовании количественного анализа. При этом могут быть использованы такие типы измерений, как измерение по конечной точке и измерение по двум точкам, а также кинетические измерения.

Качественный анализ — фотометрические измерения

При выполнении качественного анализа, абсолютные значения концентрации не рассчитываются. Данные измерений носят качественный характер, благодаря применению установленных пороговых значений, или ограничительных уровней cut-off. Значение cut-off может быть фиксированной величиной, или может быть рассчитано с помощью уравнения. В уравнениях используются значения оптической плотности отрицательных и/или положительных контролей.

Измеренные значения оптической плотности исследуемых проб сравниваются со значением (значениями) cut-off, и определяются, например, как отрицательные, положительные, низкие положительные, высокие положительные и т.д. Заметим, что расчеты cut-off также могут применяться в количественном анализе.

Качественный анализ с использованием расчета ограничительных уровней cut-off интенсивно используется для скрининговых исследований. Скрининговые тесты широко практикуются в серологии и вирусологии, причем типичными примерами здесь являются иммунологические анализы для определения гепатита или ВИЧ.

Измерение по конечной точке — фотометрические измерения

При измерении по конечной точке фотометр производит однократное измерение оптической плотности проб. Измерение производится после того, как достигается стабильное плато величины оптической плотности или реакция останавливается после соответствующего инкубационного периода. Ход реакции можно видеть на рисунке “Ход реакции”. Вычисление результатов основывается на использовании калибровочной кривой. Для расчета калибровочной кривой (рисунок Калибровочная кривая в ИФА-анализе), используются измеренные значения оптической плотности стандартов и их заданная концентрация.

Ход реакции фотометрические измерения

Для того чтобы исключить некоторые источники погрешности, присущие анализу с измерением по конечной точке, используйте метод кинетического исследования, поскольку измерения в кинетическом режиме обеспечивают получение более точных результатов.

Калибровочная кривая в ИФА-анализе

Измерение по двум точкам — фотометрические измерения

При использовании метода измерения по двум точкам, фотометр производит измерение значения оптической плотности проб дважды: (А1) до начала реакции и (А2) после того, как реакция завершена. Ход реакции показан на Рисунке.

Ход реакции фотометрические измерения
Линейная калибровочная кривая

Результат, выраженный в единицах концентрации, рассчитывается по изменению значения оптической плотности (DA=А2-А1) или с использованием коэффициента, либо с помощью калибровочной кривой (Рисунок 5.13), которая рассчитывается по разности значений оптической плотности, измеренной для стандартов с известной концентрацией.

Кинетические измерения

При кинетических измерениях, фотометр производит измерение оптической плотности проб, по крайней мере, три раза. Количество точек измерения определяется заданными параметрами измерений. Измерения производятся через определенные интервалы времени. Данные кинетических измерений должны быть обработаны до того, как будут выполняться дальнейшие расчеты.

Один из наиболее часто используемых видов кинетических расчетов представляет собой расчет наклона, выраженного в единицах разности значений оптической плотности в минуту: DА/мин (кинетическая скорость). Существуют другие виды кинетических расчетов: расчет максимальной скорости, времени до момента максимальной скорости, время до максимального значения оптической плотности, полная разность значений оптической плотности и т.д.

Кинетические измерения, например, используются при изучении кинетики ферментов, механизма реакций и свойств ферментов. При проведении ИФА-исследований кинетические измерения обеспечивают самую высокую чувствительность и точность. При проведении многих видов исследований, применяемых в области клинической химии, таких, как определение ALT, креатинина, фосфатазы, и т. д., необходимо использование кинетических измерений.

Определение конечного значения концентрации основано на расчете калибровочной кривой, или, в некоторых случаях, на определении молярной оптической плотности.

Константа молярной оптической плотности приводится для длины светового пути 10 мм. В лунке микропланшета длина светового пути не такая. Это обстоятельство необходимо учитывать в расчетах.

При выполнении кинетических измерений, т.е. при измерении скорости реакции, становится критическим изменение наклона кривой, характеризующей зависимость оптической плотности от количества субстрата. Наклон кривой, характеризующей протекание реакции, может быть как восходящий (первый рисунок), так и падающим (второй рисунок). Заметим, что при анализе активности ферментов, всегда имеется характерное время запаздывания (т. е. задержка перед выполнением первого считывания) и время реакции (т.е. полное время, в течение которого происходит анализ хода реакции).

Ход реакции с возрастанием оптической плотности
Ход реакции с падением оптической плотности

Преимущества выполнения кинетических измерений

Метод кинетических измерений при считывании данных микропланшета имеет ряд преимуществ:

  • Кинетический метод обеспечивает получение более точных результатов, поскольку он устраняет ряд погрешностей, присущих анализам с измерением по конечной точке. Такие погрешности, например, связаны с наличием временного интервала между моментом введения субстрата и проведением измерений по всем лункам, имеющимся на планшете, различиями оптической однородности лунок на планшете, и различным количеством анализируемого субстрата в лунках.
  • При сравнении результатов анализов с использованием кинетических измерений, чувствительность анализа оказывается более высокой.
  • При выполнении кинетических измерений не требуется использовать реактивы, останавливающие ход реакции (такие, как кислота). Если применяется кинетические измерения, нет необходимости знать, когда требуется останавливать реакцию.
  • Кинетический метод более точен, поскольку скорость – но не обязательно значение оптической плотности в конечной точке – прямо пропорциональна концентрации лимитирующего реактива.
  • Кинетический анализ позволяет производить измерения в более широком динамическом диапазоне значений концентрации, и поэтому для измерения неизвестных образцов требуется более низкий коэффициент разбавления.
  • При выполнении кинетических измерений сокращается время анализа, поскольку требуются сокращенные периоды инкубации анализируемого субстрата.

Также смотрите Thermo Multiskan Ascent микропланшетный фотометр.